设计:随机对照动物实验。
时间及地点:于2009年1月至2011年3月在辽宁中医药大学中心实验室完成。
材料:
动物:健康SPF级SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量(280±20) g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)2009-0004。实验前适应性喂养1周,自由饮水、摄取标准颗粒饲料,室内温度22 ℃,相对湿度45%。
眼针治疗急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织细胞间黏附因子1的表达的主要试剂及仪器:
方法:
实验动物分组:SD大鼠40只按随机数字法分为对照组、假手术组、模型组、眼针穴区组和穴区外组,各8只。
大脑中动脉缺血再灌注损伤模型的制备:参照文献[14],模型组、眼针穴区组和穴区外组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。在室温(22 ℃)条件下,大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧固定于手术台上,颈部消毒后正中偏右0.5 cm处纵向切开2 cm切口,分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。其中颈外动脉需暴露出3-5 mm,颈内动脉需分离至翼腭动脉。在颈外动脉远端距颈总动脉分叉处3-5 mm处结扎颈外动脉,再用电凝器在结扎点远心端电凝颈外动脉,用眼科手术剪在结扎点和电凝点之间剪断颈外动脉。然后将颈外动脉向鼠尾方向牵拉,使颈外动脉和 颈内动脉成一条直线。动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端,在颈外动脉结扎点前端剪一“V”形小口,缓慢将栓塞线经颈外动脉插入颈内动脉,打开颈内动脉远心端的动脉夹。栓塞线插入深度1.8-2.2 cm。结扎颈外动脉,逐层缝合。模型组、眼针穴区组和穴区外组于缺血2 h进行再灌注。假手术组未插入栓塞线。正常组未做处理。
模型成功的评价:模型组、眼针穴区组和穴区外组于再灌注后3 h进行神经功能缺损评分。模型的评价参照ZeaLonga 5分制评分标准[9]:①0分为无症状。②1分为不能完全伸展对侧前爪。③2分为向对侧转圈。④3分为向对侧倾倒。⑤4分为不能自发行走,意识丧失。评分为1-3分者纳入实验组,未达标准者排除。
眼针取穴及刺法:眼针组于脑缺血再灌注即刻及取材前30 min分别进行眼针治疗2次。取13 mm毫针,眼针组于大鼠眶周2 mm处针刺,定位参照人体取穴方法[14-15],取肝区、上焦区、下焦区、肾区,见图1。
针刺手法:从眼眶边缘1 mm部位平刺,左眼按照顺时针方向(右侧按逆时针方向),从该穴区起始定位线向终止定位线进针,进行平刺操作,刺入真皮,达到皮下组织,进针3 mm,到终止定位线为止。留针20 min,留针10 min时用刮柄进行刮针1次,刮针5下。穴区外组选择眼针同名穴区的外3 mm处为针刺部位,刺法与眼针穴区相同。
Western blot法检测海马组织细胞间黏附因子蛋白表达:于缺血再灌注损伤3 h对大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑组织,去掉小脑,沿两侧大脑半球连接处将大脑半球切开,剥离出病变侧海马,按组织净质量∶裂解液=1∶10的比例,加入相应体积的裂解液 (pH 7.5),将样品剪碎后匀浆、离心,上清即为总蛋白。兔抗鼠细胞间黏附因子一抗(1∶500);邻甲氧基联苯胺,β-萘基磷酸显色;扫描仪扫描硝酸纤维膜,计算灰度值。
采用实时定量PCR方法法检测海马组织细胞间黏附因子 mRNA的表达:取大鼠海马组织,细胞间黏附因子引物由北京华大基因公司合成。细胞间黏附因子上游引物:5'- CAA ACG GGA GAT GAA TGG-3';下游引物:5'-CAC GAA GCC CGC AAT-3'。β-actin上下游引物分别为:5'-CGT GCG TGA CAT TAA AGA G-3',5'-TTG CCG ATA GTG ATG ACC T-3'。所有的产物在ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT值,以管家基因β-actin 为内参,以扩增倍数作为比较的依据,△CT= CT目的基因- CTβ-actin,△△CT =△CT实验-△CT对照,扩增倍数=2-△△CT。将所扩增的PCR产物同时进行熔解曲线分析。
主要观察指标:大鼠海马组织细胞间黏附因子1蛋白和mRNA的表达水平。
统计学分析:采用SPSS 11.5统计软件分析,实验数据均采用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析, P < 0.05为差异有显著性意义。